Центрифугирование периферической крови в двойном градиенте плотности.

Центрифугирование крови в градиенте плотности применяется для выделения из неё относительно чистых лимфоцитов и гранулоцитов. Существует большое количество различных методик, они отличаются между собой по исходному объему крови, по плотности градиента и по другим критериям. Центрифугирование в двойном градиенте позволяет одновременно выделить фракцию лимфоцитов и гранулоцитов, а сам градиент состоит из раствора фиколла (плотность 1.077) и раствора рентгенконтрастного вещества – урографина или верографина (плотность 1.097). Выделенные таким способом клетки не всегда достаточно чистые, особенно фракция лимфоцитов, которая всегда загрязнена тромбоцитами, моноцитами, а также небольшим количеством гранулоцитов низкой плотности. Фракция гранулоцитов может быть загрязнена эритроцитами, такие эритроциты называют остаточными, они не ушли полностью в осадок при центрифугировании.

Методика: Стабилизированную ЭДТА, цитратом натрия или гепарином кровь центрифугировать 10 минут при 1500 об/мин для получения богатой тромбоцитами плазмы. Максимально возможный объём тромбоцитарной плазмы удалить, и заместить фосфатно-солевым буфером (рН 7.4). Рекомендуется добавление большего количества буфера (кровь:буфер 2:1) для снижения вязкости крови, что облегчает наслоение крови на градиент. Добавление большего объема также позволяет получить более чистые фракции по сравнению с неразбавленной кровью.  Раствор урографина в объёме 2 мл налить в пластиковую центрифужную пробирку, аккуратно наслоить 2 мл раствора фиколла. Важно, растворы не должны смешиваться друг с другом. На полученный градиент наслоить 2 мл подготовленной  крови и центрифугировать 35 минут при 1500 об/мин. Температурный режим 20-25̊С. 

Фракции с мононуклеарами и гранулоцитами аккуратно перенести в пластиковые пробирки. В пробирку с гранулоцитами добавить 2мл лизирующего  раствора для лизиса остаточных эритроцитов. В обе пробирки добавить по 5-10 мл фосфатного буфера и отмыть, процедуру повторить трижды.

 Полностью очистить фракцию лимфоцитов от тромбоцитов крайне сложно, но можно снизить их количество путём отбора богатой тромбоцитами плазмы при подготовке крови и трехкратным промывыванием выделенной фракции. Возможно загрязнение фракции мононуклеарных клеток гранулоцитами низкой плотности, особенно при использовании крови пациентов с тяжелыми бактериальными инфекциями. Если есть необходимость, можно произвести очистку от гранулоцитов помощью сортировки клеток с магнитной активацией.

Благодарности

Благодарю за любезную помощь в публикации статьи на сайте -  врача клинической лабораторной диагностики Зайцева Евгения Геннадьевича.